다시마 유래 항미세조류 물질 추출 및 알긴산 올리고 유도체의 막전위에 대한 영향

   1980년대 이후 변화된 환경요인으로 인하여 발생빈도 가 날로 증가하고 있는 적조현상은 국내 . 외 연구기관에 본 논문은 논문은 해양과학기술원(PE98753, PK08080)의 연구과제로 수행되었음. * Correpsonding Author : Taek-Kyun Lee (Korea Institute Ocean Science & Technology) Tel: +82-55-639-8630 email: Received August 23, 2012 Revised October 12, 2012 Accepted December 6, 2012

   서 많은 연구가 수행되어 왔으며 [1, 2], 적조생물이 대량 번식하여 독성물질을 분비하고 해수내의 용존산소를 고 갈시켜 어패류 등에 피해를 초래해 왔던 것은 이미 잘 알 려져 있다.
생태학 및 생리학적 연구를 수행하였다.적조생물의 제거를 위해서 현재 사용되고 있는 대표적 인 방법은 황토 살포방법이다 [3]. 그러나 황토 살포방법 을 계속 사용할 경우 육상에서의 황토개발에 따른 환경 파괴 문제와 바다로의 계속적인 황토 유입은 바다의 저 질상을 변화시켜 저서생물의 천이 등 생태계의 변화를 유발할 가능성을 가지고 있다. 적조생물 방제를 위해 황 2.1 실험재료 및 고분자 알긴산 추출 토 이외에 화학처리제 및 박테리아에 의한 제거 등이 연 자연건조한 다시마 (Laminaria spp.)를 미세하게 분쇄 구되어 왔지만 [4, 5], 2차 환경 오염 및 그 실효성에 있어 한 후 NaHCO 3 용액으로 다시마에 함유되어 있는 알긴산 서 의문이 제기되고 있는 실정이다. 따라서 적조생물의 을 분리하였다. 이를 메탄올을 이용하여 분말결정화한 후 제거를 위해 환경오염의 피해를 최소화할 수 있고, 살상 동결건조하여 고분자 알긴산 분말을 얻었다. 효과가 탁월한 물질에 대한 연구의 필요성은 오랫동안 제기되어 왔다 [6]. 2.2 알긴산 올리고 유도체 생산 해조류의 추출물을 이용한 연구는 과거 약 40 여 년 0.5 L 삼구 플라스크에 고분자 알긴산 간 연구되었으며, 추출물을 이용한 생명공학은 최근에 들 고 2 N HCl 내에서 80 °C 에서 단위 어 선진국들을 중심으로 활발히 진행되고 있다 [7]. 추출 로 시료를 채취하여 미세조류에 처리하였으며 가장 효율 물 중 대표적인 것은 다당류이며, 특히 agar, agarose, 이 좋은 시간대의 시료를 다음반응에 사용하였다. carrageenan, alginate, fucan, xylan 등이 홍조류, 갈조류 반응물에 1% H 2 O 2 를 첨가하여 °C 에서 반응시키면서 및 녹조류에서 얻어지고 있다 [8, 9]. 해조류 추출물 또는 가수분해된 저분자 알긴산은 시간별로 채취하여 그 유도체는 항바이러스, 항박테리아 기능 외에 콜레스테 로 조절하고 이를 생물체에 처리하여 항생기능의 존재 롤 농도를 낮추고, 면역학적 반응 안정화시키는 등의 기 유무를 확인하였다. 능이 알려지면서 [10], 전세계적으로 생물자원으로서 뿐 만 아니라 의약품의 원료로서 연구되고 있다 [11]. 2.3 추출된 알긴산의 분자량 분포와 정량 갈조류에서 추출되는 알긴산 (alginate)은 세포벽에 존 재하는 다당류이다. 알긴산은 만누론산 (D-mannuronic 분리된 알긴산의 분자량 분포 조사를 위하여 acid)과 글루론산 (L-guluronic acid) 단량체로 구성되어 Brookfield 점도계를 사용하여 100 rpm으로 측정하였고, 있으며, 배열순서와 조성은 추출종 및 추출부위에 따라 최초 사용된 알긴산의 순도를 확인하기 위한 총 uronic 다르고 기능도 다양하게 나타난다 [12]. 알긴산의 생체내 acid 함량 측정은 Haug와 Larsen (1962)의 표준 가수분해 합성은 주로 Pseudomonas aeroginosa., Azotobacter 방법에 의해 실시하였다 [16]. 분자량 분포도 분석은 gel vinelandii 등 박테리아에서 연구되었으며 세포내에서 permeation 크로마토그래피 분석시스템 (JASCO, Model fructose-6-phosphate로부터 합성되어 GDP-만누론산이 형 LC-90, Jasco Co., 일본)을 이용하였다. 성된다. GDP-만누론산은 세포바깥으로 분비되면서 에피 추출물내의 분자량 측정은 Usov et al (1995) 방법을 머화 반응, 중합반응, 아세틸화 등의 과정을 거쳐 알긴산 수정하여 사용하였다 [17]. 0.5 mL 알긴산 용액과 0.5 mL 을 형성하고, 이는 세포벽 바깥을 감싸는 형태로 존재하 borate 및 4 mL의 황산을 섞었다. 섞은 용액은 70 °C , 40 게 된다 [13]. 알긴산은 겔형성, 수분함유능, 상처보호, 건 분 간 처리한 후 빠르게 식혔다. 3,5-dimethylphenol 0.1 조조절 등의 기능을 이용하여 직물, 식품산업, 의약품산 mL을 첨가한 후 실온에서 10분 간 방치하였다. 업 등의 원료로 사용되고 있다. 알긴산의 항생기능에 관 Spectrophotometer를 이용하여 450과 400 nm를 측정하였 한 연구는 1980년대 갈조류 추출물 중에 항바이러스, 항 고, 물을 blank로 사용하였다. 450과 400 nm의 흡광도 차 박테리아, 항균, 항종양 기능 등이 있음을 확인하였지만 이가 알긴산 농도이고 표준물질로는 sodium alginate를 [14, 15], 이들의 산업적 이용 및 세포에 대한 작용기작에 사용하였다. 관하여는 거의 이해되지 않고 있다. 이에 따라 본 연구에서는 적조생물의 사멸에 탁월한 2.4 기작 연구 작용을 하며 환경오염을 최소화할 수 있는 물질에 대해 삼투압 변화로 인한 세포사멸 유도를 관찰하기 위하여 연구하고자 했고, 해조류 추출물에 의한 적조생물의 사멸 만니톨 (mannitol)을 삼투압조절제로 사용하였고, 만니톨 에 관한 연구를 하였다. 또한 해조류 추출물의 작용기작 을 0.05-1.0%까지 처리한 후 시간별로 식물플랑크톤의 을 연구함으로써 적조방제에 관한 연구뿐만 아니라 해양 사멸을 관찰하였다.
   10 g을 첨가하 반응시키면서 1시간

   HCl

   80

   pH를 8
세포 내 ‧ 외의 pH 변화 측정은 Lee 등 (1999)의 방법을 따라 수행하였다 [18]. 세포외 pH (pHe) 변화는 pH electrode (ATI Orion 420A, USA)를 이용하여 지정된 시 간에 측정하였다. 세포내 pH (pHi)는 Kurkdjian 등 (1978) 의 방법을 일부 수정하여 진행하였다 [19]. 활발하게 성 장하고 있는 미세조류 1 mL을 채취한 후 10,000 g, 2분 간 원심분리 하였다. 세포를 0.1 M K-phosphate (pH 6.0) 용액으로 세척한 후, K-phosphate (pH 6.0) 용액 760 μL 에 재현탁 하였다. 미세조류 현탁액을 시험관으로 옮기 고, 200 rpm, 25 °C 으로 세팅된 교반배양기에서 1 μL의 [ 14 C]DMO (about 10 5 cpm)와 8 μL의 cold DMO 첨가하 였다. 10분 후 200 μL의 세포를 nitrocellulose filter (구경 0.45 μM)를 이용하여 걸렀다. 걸러진 미세조류는 2 mL의 냉각 증류수로 두 번 세척 한 후 10 mL의 scintillation cocktail을 첨가하고 미세조류 내에 존재하는 방사능의 양을 측정하였다. pHi는 아래의 공식에 의해 계산되었다. pHc= 6.3±log 10 [(cpm i ×760)/(cpm a ×166)] cpm i , total cpm of the filter; cpm a , total cpm of filtered solution.
   3.1 갈조류로부터 알긴산 추출, 함량, 분자량 다시마로부터 고분자의 알긴산을 추출하고, 이를 미세 조류의 사멸에 사용하기 위하여 HCl과 H 2 O 2 를 차례로 처리하여 가수분해 시켰다. 2 N HCl에 의해 추출된 추출 물을 시간별로 채취하고 pH를 조정한 후 0.05%의 알긴 산을 Akashiwo sanguinea와 Cochlodinium polykrikoides 에 처리하여 항미세조류 기능을 관찰하였다 [표 1, 2]. 고 분자 알긴산을 2 N HCl에서 반응시켰을 때 3시간 이후 는 항미세조류 기능이 증가하는 것으로 나타났고, 4시간 이후에는 효율이 거의 변화가 없었다 [표 1]. 따라서 2 N HCl에서 4시간 반응 후 다음 단계인 1% H 2 O 2 반응을 실 시하였다. 2 N HCl에서 4시간 반응한 추출물에 1% H 2 O 2 를 첨가하고, 시간별로 반응물을 미세조류에 처리하여 항 미세조류 기능을 알아보았는데 반응시간이 4시간 이후부 터는 약 5분내에 90%의 미세조류가 사멸하는 것이 관찰 되었다[표 2]. 따라서 다시마로부터 추출된 고분자 알긴 산을 2 N HCl과 1% H 2 O 2 에 연속적으로 반응시켰을 때 항미세조류 활성을 갖게 되었고, 2 N HCl과 1% H 2 O 2 에 서 각각 4시간씩 반응시켰을 때 최적의 항미세조류 기능 이 있는 반응물이 생성되었다.

   [Table 1] Anti-microalgal effect of alginate extracted with 2 N HCl. Incubation Killing effect on microalgae within 5 min time for (% dead cells/live cells) extraction A. sanguinea C. polykrikoides 1 10 0 2 20 10 3 30 25 4 50 60 5 55 55 6 50 50 7 60 60 8 50 55 [Table 2] Anti-microalgal effect of alginate extracted with 1% H 2 O 2 followed 2 N HCl for 4 hr. Incubation Killing effect on microalgae within 5 min time for (% dead cells/live cells) extraction A. sanguinea C. polykrikoides 1 50 60 2 60 50 3 80 70 4 90 90 5 95 90 6 80 90 7 90 90 8 90 90 3.2 미세조류 사멸 미세조류의 사멸에 대한 알긴산 올리고 유도체의 농도 영향을 살펴보고자, 표시된 농도의 알긴산 올리고 유도체 를 A. sanguinea와 C. polykrikoides에 처리하였다. 0.05% (w/v) 이상의 알긴산 올리고 유도체를 첨가하였을 때, 첨 가하자마자 90% 이상의 세포가 사멸하였다 [그림 1]. A. 500 Gymnodinium sanguineum Cochlodinium polykrikoises
300 death of 200 Time 100 0 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 Alginate concentration (%, w/v) [Fig. 1] Effect of oligo-alginate derivatives concentration on the death of microalgae.
   sanguinea는 알긴산 올리고 유도체 농도가 증가함에 따 라 사멸시간이 감소하는 반면, C. polykrikoides는 0.02% 까지는 사멸시간이 감소하지 않았는데 이는 건강한 시기 에 사슬을 형성하는 C. polykrikoides가 사멸과정에서 사 슬형태가 단일세포로 분리되는데 필요한 필요한 시간이 요구되는 것으로 판단된다. 추출된 저분자 알긴산 올리고 유도체 0.05%를 A. sanguinea와 C. polykrikoides에 처리하여 세포사멸을 관 찰하였다 [그림 2, 3]. A. sanguinea는 알긴산 올리고 유도 체를 처리하자마자 세포의 움직임이 크게 둔화되었고, 일 부는 세포가 터지는 현상이 관찰되었다. 동일한 농도의 알긴산 올리고 유도체를 C. polykrikoides에 처리하였을 때, C. polykrikoides의 움직임이 정지하였으며, 사슬형태 가 단일세포로 분리되었고, 원형질이 축소되는 원형질분 리 현상이 일어나 사멸하였다.
[Fig. 2] Death of A. sanguinea exposed to 0.5% oligo-alginate derivatives.
   [Fig. 3] Death of C. polykrikoides exposed to 0.5% oligo-alginate derivatives. 3.3 기작 연구 알긴산 올리고 유도체가 보유하고 있는 항생기능에 대 한 작용기작을 설명하기 위하여 1) 알긴산 올리고 유도체 에 의한 세포 내 ‧ 외의 삼투압 변화 및 이를 통한 세포의 팽창 및 수축, 2) 알긴산 올리고 유도체에 의한 세포내 신 호전달체계 (signal transduction pathway)의 교란에 의한 탈수 및 사멸 등 알긴산 올리고 유도체에 의한 직접적인 작용과 간접적인 작용으로 구분하여 조사하였다. 직접적으로 알긴산 올리고 유도체가 세포 내 ‧ 외의 삼 투압을 변화시켜 세포의 파쇄를 이루었는지를 관찰하기 위해, 일반적으로 세포배양시에 삼투압조절제로 사용되 는 만니톨 (mannitol)을 대조구로 하여 실험하였다. 알긴 산 올리고 유도체 처리농도의 약 10배인 0.5-1.0%의 만니

   톨을 처리하였을 때 적조생물의 사멸에는 전혀 영향을 미치지 않는 것이 관찰되어 (자료 미제시), 알긴산 올리 고 유도체 처리시 단순한 삼투압 변화를 유도하여 사멸 하는 것은 아닌 것으로 추정되었다. 동물세포에 작용하여 탈수를 일으키고 세포를 죽이는 cholera toxin의 경우 세포막에 존재하는 G protein의 α subunit를 활성화시켜 세포내 물의 수송에 관여하는 신호 전달체계를 교란하고 이를 통하여 탈수를 일으키는 것으 로 알려져 있다 [20]. 또한 고등식물의 사멸을 유도하는 elicitor는 식물세포내의 pH를 감소시키고 Ca ++ , K + 등의 농도를 낮추어 새포내 신호전달체계를 교란시켜 사멸시 키는 과정은 잘 알려져 있다 [19, 21]. 본 연구에서는 미 세조류 중의 하나인 C. polykrikoides에 알긴산 올리고 유 도체를 처리하고 세포내 pH 변화를 조사하여, 미세조류 사멸에 대한 알긴산 올리고 유도체의 간접적인 영향을 분석하였다. 연구결과 세포내 pH는 약 0.3 unit 감소하고, 세포외 pH는 0.9 unit 증가하였다 [표 3]. 이러한 세포 내 ‧ 외의 pH 변화는 미세조류 세포의 막전위 변화를 의미하 며, 막전위 변화가 미세조류 세포내 신호전달체계를 변화 시켜 물 수송의 변화를 유도하고, 이러한 결과로 인하여 미세조류가 사멸되는 것으로 추측된다. [Table 3] Intra- (pHi) and extracellular pH (pHe) changes of microalgae by treatment of alginate. Incubation time pHi pHe 0 min 6.43±0.12 6.32±0.15 5 min 6.36±0.09 6.39±0.12 30 min 6.21±0.11 6.92±0.07 1 hr 6.13±0.14 7.02±0.11 2 hr 6.11±0.13 7.21±0.12 3 hr 6.11±0.17 7.20±0.10 본 연구에서 추출한 알긴산 올리고 유도체는 천연 해 조류인 다시마로부터 추출한 알긴산 올리고당 유도체로 서, 적조생물의 사멸에 대한 실험 결과는 이제까지 보고 된 어떠한 적조사멸제에 비해 뒤떨어지지 않는 효과를 보이는 것이며, 기존의 화학적 적조사멸 방법은 이차적인 환경오염의 유발가능성으로 인하여 실제 사용하기에 문 제점이 있으나, 알긴산 올리고 유도체는 천연해조류로부 터 추출한 물질이고, 그 구성성분이 올리고당이므로 거의 환경오염을 일으키지 않을 것으로 기대된다. 본 연구에서는 알긴산 올리고 유도체가 적조방제를 위 한 황토대체물질로서 활용이 가능하며, 적조방제물질의 살포에 따른 환경오염을 경감시킬 수 있을 것으로 기대 하고 있다. 또한 알긴산 올리고 유도체을 어병치료제로

   개발하고 박테리아, 바이러스, 균류 및 암세포에 처리하 여 항박테리아, 항바이러스, 항균 및 항암 효과 가능성 및 실용화 여부를 타진하는 연구를 수행하고 있으며, 이를 통한 의약품 원료로서의 가능성을 연구하고 있다. 알긴산 올리고 유도체의 추출 및 작용기작에 관한 연구는 천연 해조류로부터의 유용자원을 추출하고, 기능성 보유에 관 한 연구를 확대시킬 수 있는 기초자료로서의 가치뿐만 아니라 국내 경제, 산업, 사회적 파급효과가 클 것으로 기 대된다.

   1) 다시마로부터 추출된 고분자 알긴산을 2 N HCl과 1% H 2 O 2 에 연속적으로 반응시켜 항미세조류 활성 을 갖는 알긴산 올리고 유도체를 제조하였고, 2 N HCl과 1% H 2 O 2 에서 각각 4시간씩 반응시켰을 때 최적의 항미세조류 기능이 있는 반응물이 생성되었다. 2) 미세조류 사멸에 대한 알긴산 올리고 유도체의 농 도별 영향을 분석하였을 때, 0.05% (w/v) 이상의 농 도에서 90% 이상의 세포가 사멸하였다. 3) 0.05%의 알긴산 올리고 유도체를 처리하였을 때, A. sanguinea는 세포의 움직임이 크게 둔화되었고, 일부는 세포가 파쇄되었다. C. polykrikoides의 움직 임이 정지하고 사슬모양에서 단일세포로 분리되었 으며, 원형질분리가 일어나 사멸하였다. 4) 알긴산 올리고 유도체의 항미세조류 활성은 세포 내 ‧ 외의 pH 변화가 세포내 신호전달체계를 변화시 켜 미세조류의 사멸을 유도하는 것으로 추측된다.